Preparando futuros biotecnologistas

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Se você estiver interessado em biologia, especialmente se estiver ensinando esse assunto, meu artigo sobre a preparação e a condução de trabalhos de laboratório para identificar um gene geneticamente estranho no DNA de alimentos será útil para você.



A polémica em torno dos OGM, bem como as incessantes discussões científicas e éticas sobre a legitimidade da intervenção humana nos “assuntos da Natureza / Deus”, serão deixados para os filósofos. Afirmamos apenas que a competência profissional de um biólogo, biotecnologista, bioinformática e genética moderno é inconcebível sem a capacidade de pesquisar e, se necessário, alterar genes. Já na escola, e mais tarde na universidade, os experimentos e experimentos biotecnológicos exigem que os alunos e alunos definam tarefas claras, compreendam a metodologia do experimento e a capacidade de analisar dados. Tudo isso desenvolve a curiosidade e a confiança, cria uma base para uma maior exploração de questões e problemas associados à pesquisa científica. Meu PLANO-CONSPECTARcom base em 3 testes realizados com reagentes BioRad e equipamento padrão necessário para análises de PCR. Mas, é claro, qualquer outro KIT pode ser usado para detectar OGM. Todas as nuances do experimento (protocolos) são detalhadas na documentação que acompanha os reagentes, portanto, não irei me alongar sobre eles. Portanto, o esboço do plano carrega 2 nomes: PLANO - porque é necessário planejar de forma clara e minuciosa o conteúdo da lição, e CONSPECT - porque é necessário pensar com antecedência em que material ensinar às crianças e em que enfocar a fim de revelar totalmente o propósito do experimento.



Plano



A experiência é projetada para duas sessões.



Aula um:



1. Familiarização teórica dos alunos com os fundamentos da estratégia de detecção de OGM (alvos para detecção e identificação).

2. Isolamento do DNA da comida (um aluno ou aluno traz qualquer produto de sua escolha).

3. Realização da reação em cadeia da polimerase.



Segunda lição:

4. Eletroforese em gel e discussão.

5. Comentários finais do professor.



Resumo



Primeira lição



1. De onde vêm os novos genes e elementos auxiliares (15-20 minutos)



Organismos geneticamente modificados são organismos que possuem uma combinação estranha de material genético obtido por meio da biotecnologia moderna. Por exemplo, usando plasmídeos Ti, genes estranhos e características de plantas geneticamente modificadas podem ser genes que fornecem resistência a herbicidas (cp4, epsps, gox), resistência a pragas (cry) ou genes que alteram a qualidade do produto (PG, Bay TE). Para a expressão de um gene estranho em uma célula hospedeira, elementos genéticos adicionais são necessários:



  • promotor - uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida pela RNA polimerase como um marcador de iniciação da transcrição;
  • – , - ;
  • - – ( ), ;
  • – , , .


O projeto do plasmídeo também contém um gene do cloroplasto altamente conservado do Fotossistema II - parte da reação de luz da fotossíntese para confirmar que o DNA viável foi extraído e que um resultado GM negativo não está associado a uma matriz inviável.



A identificação de DNA recombinante em alimentos pode ser feita de várias maneiras, conforme mostrado na Figura 1.



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Figura 1. Identificação de DNA recombinante em alimentos



Os kits de reagentes prontos para uso mais comuns usados ​​para identificar produtos OGM são baseados na identificação de um promotor e terminador. O GMO Investigator Kit da BioRad usa PCR e eletroforese de DNA para verificar a presença de duas sequências de DNA diferentes associadas a OGMs: o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor e o terminador do gene da nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens. Essas sequências de DNA são encontradas em> 85% das plantas geneticamente modificadas comercializadas em todo o mundo. O novo gene presente no DNA do controle positivo é o epsps. Como um controle da integridade do DNA vegetal extraído dos alimentos, o PCR é usado para amplificar uma parte do gene do cloroplasto do fotossistema II que é comum à maioria das plantas superiores. Portanto, o teste tem como alvo 3 alvos: um promotor,terminador e parte do gene do cloroplasto do fotossistema II, respectivamente, em um conjunto de 3 primers, dois dos quais (primers do promotor e terminador) foram misturados. Portanto, há 2 frascos no conjunto: vermelho - primers OGM, usados ​​para determinar se o alimento contém OGMs e verde - Fotossistema II da planta, usado para determinar se o DNA foi extraído de material vegetal.



Após a palestra introdutória, os alunos devem se familiarizar com o protocolo de extração de DNA e PCR, explicar passo a passo o curso do experimento e focar nas características de trabalhar com um KIT de um determinado fabricante.



2. Isolamento de DNA de alimentos (15-20 minutos)



Dependendo dos empregos disponíveis, as crianças podem ser divididas em grupos de 2 a 3 pessoas, cada uma escolhendo um produto alimentar interessante para análise. Batatas fritas ou pipocas, tão apreciadas pelas crianças em idade escolar, são bem-vindas como material de pesquisa, uma vez que quase todas as batatas e milho de onde são feitas as guloseimas crocantes carregam genes estranhos e é muito fácil identificar neles OGM. Ou frutas vermelhas, por exemplo, morangos, mirtilos, pão com sementes de girassol. Mas é aconselhável combinar com antecedência quem vai testar qual produto, pois os KITs para extração de DNA são projetados para determinados produtos e, por exemplo, o usado neste caso não implica no isolamento de DNA de farinha, óleo, temperos, flocos de milho, etc.



Nos experimentos que descrevi, o DNA foi isolado de mirtilos, pepinos e sementes de girassol.

Características distintivas deste estudo:



  1. Pré-pesagem da amostra (1 g) e trituração completa com argamassa. A trituração é necessária para destruir as paredes celulares bastante densas das plantas (que as células animais não possuem).
  2. Isolamento com uma matriz InstaGene homogeneizada (embora, é claro, um detergente possa ser usado) sem adição de proteases (destruição de proteínas celulares) e sem precipitação de DNA com sais, uma vez que o sal já está no InstaGene.
  3. Não há sorvente no KIT, portanto, sem eluição - a princípio, as crianças não podem prestar atenção nisso.


Por que a Matriz InstaGene foi usada em princípio? Porque esta é uma maneira bastante rápida de isolar o DNA - em 15-20 minutos, o que economiza significativamente o tempo da aula. InstaGene também quela íons divalentes (por exemplo, Mg2), que são necessários para enzimas que destroem DNA (por exemplo, DNase).



3. Realização da reação em cadeia da polimerase



Após o isolamento bem-sucedido do DNA dos alimentos pelas crianças, de acordo com os protocolos do fabricante, são preparadas misturas de PCR para 6 tubos Eppendorf de acordo com a Tabela 1 (10-15 minutos).



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Depois disso, a 1ª parte do experimento termina. O próprio professor coloca os tubos no amplificador e define os modos de amplificação de acordo com o protocolo.



Segunda aula



4. Eletroforese em gel e discussão (40-45 minutos) As



crianças preparam um gel de agarose a 3% em tampão TAE. Enquanto a eletroforese dura (200 V 20 minutos), você pode discutir as opções prováveis ​​para os resultados (Figura 2). E depois de receber as fotos, discuta os possíveis erros.



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Figura 2. Resultados de teste possíveis

Referência



Por exemplo, no grupo de crianças que testou pepinos, nenhum amplicon foi observado (Figura 3).



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Figura 3. Imagem em gel da eletroforese da amostra (pepino)

⁕ - controles (- sem OGM, + contendo OGM); T - amostra de teste; M - marcador de peso molecular; PMM - primer do fotossistema II; OGM é uma cartilha para OGM.




Discussão sobre os resultados de 1 amostra:neste caso, nenhum iniciador foi adicionado à mistura de amplificação.



A segunda experiência é testar o DNA de sementes de girassol (Figura 4).



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Figura 4. Gel-imagem de eletroforese de amostra de sementes de girassol

⁕ - controles (- não contém OGM, + contém OGM); T - amostra de teste; M - marcador de peso molecular; PMM - primer do fotossistema II; OGM é uma cartilha para OGM.




Discussão sobre os resultados da 2ª amostra:o controle negativo (bolsa de gel 2), em cujo genoma não havia genes modificados, não contém amplicons. Isto indica que o primer não reconheceu a região de sequenciação do promotor 35S e do terminador NOS. O padrão oposto com a detecção de um amplicon de cerca de 200 pares de bases foi observado na 6ª bolsa de gel (controle positivo - controle geneticamente modificado). Visualmente, apenas um produto de amplificação com um comprimento de cerca de 200 bp foi obtido no OGM de controle positivo (bolsa de gel 6), mas os produtos de amplificação do promotor e terminador eram quase do mesmo tamanho (203 bp e 225 bp, respectivamente (BioRad)), então que podemos supor que existem dois produtos de amplificação no bolso de gel 6.Na maioria dos estudos, o promotor 35S e o terminador NOS são os mais comumente usados ​​e podem ser usados ​​para detectar genes modificados em mais de 85% dos casos. Este método é suficiente para responder à pergunta se o promotor e / ou terminador acima estava presente, mas este método não é suficiente para responder quais genes foram inseridos.



Amplicons específicos para o gene do cloroplasto do fotossistema II podem ser encontrados em todas as 3 amostras de alimentos (bolsas 1, 3, 5), tanto aquelas contendo genes modificados quanto aquelas que não contêm genes modificados. As amostras estudadas não continham os amplicons do terminador NOS ou do promotor 35S (bolso 4). Apesar do experimento ter sido realizado com sucesso e os alunos receberem um resultado inequívoco, a foto não é muito clara, como se estivesse nublada. Como esse fenômeno se estendeu a todo o gel, pode-se concluir que ocorreu contaminação durante a preparação do tampão TAE 1x. Provavelmente foi vidro contaminado no laboratório.



A experiência mais recente é testar mirtilos (Figura 5).



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Figura 5. Eletroforese de imagem em gel de amostra de mirtilo

⁕ - controles (- não contém OGM, + contém OGM); T - amostra de teste; M - marcador de peso molecular; PMM - primer do fotossistema II; OGM é uma cartilha para OGM.




Discussão sobre os resultados de 3 amostras: após a execução do gel, o gel de agarose é visualizado de cima para baixo. Todas as 3 amostras de alimentos contêm amplicons característicos do gene do cloroplasto do fotossistema II. Uma banda pode ser vista no controle negativo (com primers OGM), por ser um controle geneticamente livre, isso é muito estranho. Nenhum amplicon de cerca de 200 pares de bases era esperado. Banda de 200 bp também aparece na amostra teste (mirtilo) e no controle positivo. Isto indica que o primer reconheceu o local de sequenciação do promotor 35S do terminador NOS.



Mas porque o teste de uma amostra de mirtilo resultou positivo (geneticamente modificado), isso pode ser devido ao fato de que mirtilo é uma espécie de planta transgênica natural.

A amostra em estudo é provavelmente um exemplo da interferência de um organismo com outro organismo usando bactérias do solo (tumefaciens). Um exemplo de transferência transgênica natural em mirtilos já foi identificado por Tatyana Matveeva, Doutora em Ciências Biológicas, Professora do Instituto de Genética e Biotecnologia da Faculdade de Biologia da Universidade Estadual de São Petersburgo. Ela e seus colegas do instituto compilaram um catálogo mundial de plantas com genomas já sequenciados. Das 275 espécies de plantas estudadas, 23 eram transgenes naturais. Incluindo cultivar de amendoim, cultivar de noz, lúpulo, goiaba tropical, cravo, cerejas do Suriname, cranberries e mirtilos. (Matveeva, 2019).



Portanto, existe a suposição de que o mirtilo estudado é um transgene natural.



5. 2



Parece que a realização do PCR é simples, mas a solução de problemas pode ser mais difícil se o amplicon desejado não for obtido ou se surgirem fragmentos não específicos. Na maioria das vezes, estamos falando sobre vidro contaminado no laboratório. Para evitar a contaminação de reagentes e abordagens de PCR, deve-se ter cuidado ao usar pontas de pipeta novas para cada processo de pipetagem. Além disso, faz sentido trocar de luvas com mais frequência durante o trabalho. Além disso, recipientes de reação e soluções novos e esterilizados devem sempre ser usados ​​e devem ser devidamente rotulados para rastrear claramente a contaminação. Pode haver muitos motivos pelos quais o PCR não funciona. Vários parâmetros químicos e físicos devem ser observados para uma PCR bem-sucedida. Infelizmente, muitas vezes acontece que, após a PCR, os resultados desejados não são obtidos.



Uma vez que mesmo as menores quantidades de DNA podem ser detectadas por PCR, é extremamente importante evitar a contaminação de misturas de reação de PCR com produtos de PCR de experimentos anteriores ou "DNA estranho" de outras fontes.



Resultado



A experiência na detecção de OGM em alimentos visa o ganho de habilidades práticas na realização da reação em cadeia da polimerase. Apesar de ser proposto um plano de sinopse, elaborado para 2 aulas, o intervalo entre as quais é de pelo menos um dia, no entanto, o cenário típico fica ao critério do professor. As seções analíticas deste estudo são projetadas para orientar os alunos através do processo de descoberta e compreensão de conceitos que são relevantes para procedimentos e análise de dados em cada estágio da jornada. Espera-se que esta abordagem (em comparação com o professor dando aos alunos todas as informações básicas) torne todo o estudo mais compreensível para um número maior de alunos. Desde que o professor tenha a oportunidade de verificar o progresso e o nível de compreensão de cada grupo (durante 2 aulas),algum grau de independência é possível, se desejado. Esta abordagem permite que mais alunos adquiram as habilidades desejadas, conforme definido acima.



Lista da literatura usada:



  1. bio-rad, „www.bio-rad.com,“ 03 Februar 2020. [Online]
  2. Matveeva T., Ottem L. (2019). Ocorrência generalizada de transformação genética natural de plantas por Agrobacterium. Plant Molecular Biology, 101, 415-437. DOI: 10.1007 / s11103-019-00913-y



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