A temperatura é um dos principais indicadores do estado do sistema biológico. Se uma pessoa desenvolve uma infecção, a temperatura corporal aumenta (geralmente, mas nem sempre), o que é um sinal da resposta do sistema imunológico à ameaça. Em outras palavras, a temperatura pode ser usada para determinar o estado aproximado do corpo. O problema é que uma pessoa é grande (literalmente), mas, por exemplo, os nematóides têm apenas cerca de 1 mm de comprimento. Era extremamente difícil medir a temperatura de um organismo tão pequeno, mas cientistas da Universidade de Osaka (Japão) desenvolveram um método para resolver esse problema. Que meios foram usados para implementar o nanotermômetro, o que os experimentos práticos mostraram e onde esse desenvolvimento pode ser usado? Encontraremos respostas para essas perguntas no relatório dos cientistas. Ir.
Base de pesquisa
A temperatura corporal de um organismo vivo varia dependendo do grau de influência de fatores internos e externos. Estamos acostumados com o fato de que a temperatura ambiente afeta diretamente a temperatura das pessoas de sangue frio, portanto, seus valores mudam com invejável regularidade. Entretanto, mesmo em animais de sangue quente em condições fisiológicas normais, são observadas flutuações de temperatura, que podem estar associadas à termorregulação homeostática e ao metabolismo energético.
Em outras palavras, a piada é ótima aqui: "Não estou brincando, sou uma pessoa muito ocupada no celular." Medindo com precisão a temperatura e sua dinâmica em uma escala submicron, muitas informações podem ser obtidas sobre a atividade celular e molecular. O problema é que à medida que o objeto de medição diminui, a complexidade de sua conduta aumenta (é difícil colocar um termômetro comum de uma farmácia em um nematóide).
Os autores do estudo observam que os termômetros elétricos convencionais não têm resolução submicron, e a termografia no infravermelho próximo geralmente ajuda a determinar a temperatura da superfície de amostras biológicas, mas não a temperatura interna.
Claro, já existem nanotermômetros emissores de luz (por exemplo, sondas moleculares termossensíveis) que são capazes de superar essa limitação. Mas essa técnica também tem desvantagens. O principal é a estabilidade de longo prazo, ou melhor, sua ausência. Esses dispositivos não podem medir com precisão as mudanças de temperatura que demoram muito (digamos, algumas horas). Para não mencionar o efeito tóxico na amostra de tal termômetro.
Neste trabalho os cientistas descrevem o conceito de termômetro quântico nanodiamante (ND de nanodiamante ), que possui alta precisão, estabilidade e baixa toxicidade. O princípio de sua operação é o seguinte: o sensor lê a temperatura como uma mudança de frequência da ressonância magnética opticamente detectável (ODMR deressonância magnética detectada opticamente ) de centros defeituosos de vacâncias de nitrogênio (NV da vacância de nitrogênio ), que surge principalmente devido à expansão térmica da rede. O núcleo do sensor NV está profundamente embutido na estrutura do diamante e é imune a vários fatores ambientais biológicos. A introdução deste sensor quântico em organismos mais complexos torna possível ler sua atividade térmica em um local específico em tempo real. Mas o processo de implementação de tal técnica apresenta uma série de dificuldades.
Nematoda (lombriga) da espécie Caenorhabditis elegans .
Organismos modelo multicelulares, como vermes Caenorhabditis elegans, precisam de uma câmara especial que possa acomodar um corpo de tamanho milimetrado, e as próprias amostras precisam ser analisadas rapidamente para manter seu estado fisiológico. Termômetros ND quânticos movem-se muito mais rápido do que em células em cultura, mesmo se o corpo estiver desidratado, exigindo um algoritmo de rastreamento de partículas rápido. Além disso, o movimento posicional do ND e a estrutura complexa do corpo causam flutuações significativas na intensidade de fluorescência detectada, o que pode causar artefatos de medição de temperatura. A solução para esses problemas nesta etapa do estudo envolve a adequação do aparelho às características individuais da amostra analisada. A questão da versatilidade e facilidade na configuração do futuro nanotermômetro está planejada para ser considerada em trabalhos futuros,nesse ínterim, foi dada atenção ao próprio conceito e aos princípios básicos do trabalho.
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A base do nanotermômetro é um microscópio confocal de fluorescência equipado com uma unidade de irradiação de microondas (1A).
Imagem # 1
A vacância de nitrogênio ODMR pode ser medida como uma diminuição na intensidade da fluorescência induzida por laser quando a excitação de microondas ressonante de spin é aplicada, uma vez que a excitação de spin ativa a via de relaxamento não fluorescente do estado excitado para o estado fundamental ( 1B ).
A câmara de amostra é um prato descartável com fundo de vidro integrado à antena que oferece amplo acesso óptico (12 mm de diâmetro) e facilidade de uso ( 1C ), adequado para amostras delicadas, como células-tronco. Tempo desde a captura do vermeCaenorhabditis elegans faltam apenas 15 minutos para a medição real. Isso ajuda a manter o worm vivo e fornece mais dados sobre sua saúde.
Além disso, o sistema integra eficazmente o rastreamento rápido de partículas e a estimativa de temperatura em tempo real de alta precisão a partir do deslocamento central NV ODMR.
No rastreamento de partículas, o sistema mede a intensidade de fluorescência ND ao longo dos eixos xyz do microscópio e foca na fluorescência máxima correspondente a cada 4 segundos (intervalo de rastreamento mais curto é possível), durante o qual a temperatura é estimada com um tempo de amostragem de 0,5 a 1,0 segundos. ( 2A ).
Imagem No. 2
Existem vários métodos de termometria quântica, mas neste trabalho foi utilizado o método de medição ODMR de quatro pontos. Este método assume que o número de fótons detectados em todas as quatro frequências selecionadas é escalado linearmente de acordo com as mudanças na intensidade de fluorescência detectada.
No entanto, verificou-se que cada fóton subsequente mostra uma diferença na sensibilidade à luz de cerca de ± 0,5%, o que realmente cria artefatos significativos na estimativa da mudança de frequência (ou seja, ∼300 kHz, que corresponde a vários graus Celsius), especialmente no modo de fóton baixo.
Esses artefatos são provavelmente devido à assimetria dependente da potência óptica no espectro ODMR. Para medir com precisão a temperatura de sistemas óticos dinâmicos complexos (ou seja, sistemas biológicos), é necessário se livrar de tais artefatos. Portanto, um filtro de correção de erros foi adicionado ao método de medição de quatro pontos.
Para avaliar o funcionamento do sistema, juntamente com a correção de erros, medições em tempo real da temperatura ND foram realizadas durante eventos térmicos graduais. Mudanças repentinas na temperatura não poderiam ser usadas, uma vez que mudanças repentinas na temperatura causam grande desfocagem dos pontos focais e flutuações associadas na intensidade da fluorescência.
Em 2B mostra os perfis de tempo do número total de fótons (I tot) e estimativa de temperatura ND (∆T NV ) quando a temperatura da amostra (T S ) muda de 44,3 ° → 30,4 ° → 44,3 ° com um passo de ± 2,8 °. O sistema emite com precisão ∆T NV , correspondendo a T S , enquanto a posição de foco mudou significativamente, especialmente ao longo do eixo z a uma distância de mais de 30 μm ( 2C ).
Com um passo de 3 °, um deslocamento posicional de 6 μm no eixo z aparece dentro de 3-4 minutos, mas a velocidade de rastreamento é alta o suficiente para seguir a dinâmica de 105 nm / s por 96 minutos ( 2C ).
Além disso, ∆T NV demonstra claramente anticorrelação com I tot... Um estudo estatístico deste tipo de dependência da temperatura determina os valores médios para SD: I tot -1 dI tot / dT = -3,9 ± 0,7% / ° e dD / dT = - 65,4 ± 5,5 kHz / ° ( 2D ). A precisão da medição de temperatura é de ± 0,29 ° e <0,6 ° C, respectivamente, o que dá uma sensibilidade de 1,8 ° C / √Hz.
Depois de obter termometria em tempo real confiável e precisa como parte da fase de desenvolvimento, o teste de monitoramento da temperatura local foi realizado em vermes vivos.
Imagem №3 A
foto 3A mostra vermes anestesiados ND dentro, colocados perto de antenas de micro-ondas. Esses NDs estão bem dispersos em água devido à funcionalização da superfície do poliglicerol (PG depoliglicerol ) e são introduzidos por microinjeção nas gônadas (as gônadas do verme experimental).
O gráfico 3B mostra o espectro ODMR de um único ND (marcado com uma seta em 3A ). 3C mostra os perfis de tempo de I tot e ∆T NV durante um período de 1 hora conforme a temperatura T S muda .
Primeiramente, o T obj foi medido a 33,2 ° C, após 6 minutos, foi realizada uma diminuição para 25,3 ° C. Como resultado, Tobj atingiu 28,6 ° aos 35,2 minutos. ∆T NV mostrou uma mudança exata de temperatura entre dois estados estacionários: 33,2 e 28,6 ° C.
A exibição da dinâmica real da temperatura dentro dos vermes entre esses dois estados estacionários é exibida devido ao fato de que ∆T NV sempre fica atrás de T S e mostra uma resposta ligeiramente subestimada devido à capacidade de calor finita da objetiva do microscópio e do ambiente. I tot também mostra as mudanças graduais na intensidade da fluorescência causadas pela temperatura.
O rastreamento de partículas também foi satisfatório ( 3C ). Dentro de 0-15 minutos, os fótons contados mostram rajadas freqüentes devido às flutuações posicionais do ND em aproximadamente 400 nm por vários segundos.
Os resultados do teste indicam claramente a alta precisão da medição da temperatura dentro do sistema biológico em nanoescala em tempo real. Além disso, foi decidido realizar testes adicionais, antes dos quais os vermes experimentais foram submetidos a tratamento farmacológico com C 10 H 5 F 3 N 4 O (FCCP de cianeto de carbonila-4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona ), causando termogênese imóvel (grosso modo, um aumento na temperatura devido a um aumento metabolismo e sem atividade muscular adicional).
A imagem №4 na
foto 4A mostra worms ND estimulados por FCCP. E o gráfico 4B mostra o perfil de tempo de ∆T NVND marcado com uma seta nas fotos.
No sétimo minuto após o início da medição, a solução FCCP foi usada. No 32º minuto, o ∆T NV começa a aumentar gradualmente, e no 48º minuto, um aumento adicional ainda maior é observado quando o nível de mudança de temperatura sobe de 4 para 7 ° C. A febre durou cerca de 80 minutos.
Durante a estimulação, os NDs são movidos lentamente alguns micrômetros ao longo de uma hora, o que confirma os resultados de experimentos separados nos quais os NDs foram continuamente observados sob um microscópio.
O grupo de controle de vermes ( 4C e 4D ), que não foi injetado com FCCP, mostrou uma resposta ∆T NV uniforme ao longo do teste, sem nenhuma mudança óbvia de temperatura.
Para confirmar ainda mais que FCCP realmente induz um aumento na temperatura corporal em vermes, a quantificação de vermes marcados com ND foi realizada em ambos os grupos de controle e experimental ( 4E ). O gráfico indica claramente um aumento de temperatura nos vermes do grupo experimental em comparação com o controle.
Outro experimento de controle, em que nenhum tampão foi adicionado e o ∆T NV foi monitorado estaticamente, mostra que a adição do dopante faz com que o ∆T NV flutue em um determinado nível, seja devido a mudanças de temperatura ou devido a artefatos de deslocamento ODMR. No entanto, a observação de tal mudança é impossível com a adição de FCCP, que adicionalmente confirma o aumento da temperatura devido ao FCCP no grupo experimental de vermes ( 4F)
Para um conhecimento mais detalhado das nuances do estudo, recomendo que você leia o relatório dos cientistas e materiais adicionais a ele.
Epílogo
Neste estudo, os cientistas foram capazes de desenvolver uma metodologia que permite medir com precisão a temperatura dentro de um sistema biológico em nanoescala em tempo real. Exageradamente, eles conseguiram medir a temperatura corporal do verme Caenorhabditis elegans , que tem cerca de 1 mm de comprimento.
É importante entender que é muito mais fácil medir qualquer coisa em uma amostra grande do que em uma pequena. No entanto, o uso de nanodiamantes injetados no corpo dos vermes possibilitou saber a temperatura corporal do verme em condições normais. Esses nanodiamantes, entrando no corpo, começam a se mover rapidamente. Um algoritmo especialmente desenvolvido e um microscópio confocal de fluorescência tornaram possível rastrear e analisar seu movimento. Os dados obtidos permitiram determinar com precisão a temperatura corporal do verme e sua dinâmica, mesmo após a introdução de uma substância especial que provocou aumento da temperatura.
Este trabalho não apenas mostra que as tecnologias quânticas podem e devem ser aplicadas na biologia, mas também amplia o leque de possibilidades no aspecto de diagnosticar vários processos em nível macro. Muitas vezes, o estado de um sistema biológico depende direta ou indiretamente dos processos que ocorrem no interior das células, que antes eram extremamente difíceis de medir em tempo real. Tendo recebido mais informações sobre os elementos constituintes do sistema, você pode entender melhor o próprio sistema, o que, obviamente, permitirá que você influencie de forma mais eficaz seu funcionamento.
Obrigado pela atenção, fiquem curiosos e tenham um ótimo final de semana galera! :)
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