Como já sabemos há muito tempo, a natureza é uma excelente fonte de inspiração para muitos estudos, descobertas e experimentos. Pássaros e insetos alados nos mostraram que o céu é bastante viável, os mamíferos aquáticos nos mostraram como prolongar nossa permanência na água e as aranhas provaram que mesmo as menores criaturas podem criar algo incrível. No estudo que estamos considerando hoje, cientistas do Instituto de Pesquisas Físicas e Químicas (Wako, Japão) descobriram uma maneira de criar uma teia artificial usando bactérias fototróficas. Como exatamente eles conseguiram isso, quão naturais são as teias de aranha resultantes e por que as bactérias fototróficas foram usadas? Respostas a essas e outras questões nos aguardam no relatório dos cientistas. Ir.
Base de pesquisa
Para muitas pessoas, as aranhas são "oh Deus, tire-o de cima de mim!" ou "ugh, que nojento." No entanto, deixando de lado as fobias e o preconceito contra essas criaturas, pode-se considerar como esses predadores de oito patas são únicos. A anatomia da aranha é literalmente feita para a caça perfeita. Por um lado, existe um veneno que pode paralisar ou mesmo matar a presa ou o inimigo. Por outro lado, existem órgãos dos sentidos bem desenvolvidos (especialmente o tato devido à tricobothria (pelos) por todo o corpo). O cartão de visita das aranhas, que se tornou a base de muitas metáforas e bordões, é sua teia.
Um vídeo sobre como as aranhas produzem sua famosa teia.
Em seu núcleo, uma teia é uma proteína, cuja composição é rica em glicina (C 2 H 5 NO 2 ), alanina (NH 2 -CH (CH 3 ) -COOH) e serina (HO 2 C-CH (NH 2 ) CH 2 OH ) Uma teia de aranha é formada em uma glândula especial, onde está na forma líquida.
Quando a secreção da glândula é secretada por vários tubos giratórios, verrugas de aranha especiais formam fios a partir dela, que a aranha usa para construir suas armadilhas mortais.
Os fios de teia de aranha são únicos porque suas propriedades mecânicas são superiores a muitos outros materiais. Por exemplo, a resistência à tração de uma teia de aranha para uma aranha comum ( Araneus diadematus ) é 1,1-2,7 GPa, para um cabelo humano é 0,25 GPa e para o aço é 0,4-1,5 GPa. A densidade da seda da aranha é 1/6 da do aço (1,3 g / cm 3 ). Ou seja, se você contornar a Terra com uma teia, seu peso será de apenas 500 gramas. A densidade de energia de cerca de 1,2 × 108 J / m 3... A seda de aranha também é extremamente flexível, ou seja, pode esticar até 5 vezes seu comprimento original (em um estado relaxado) sem nenhuma quebra. A resistência ao impacto da teia de aranha é comparável aos fios de poliamida. As aranhas não são extremófilas, mas suas teias podem sobreviver facilmente a temperaturas de -40 ° C a 220 ° C. Além disso, as propriedades biodegradáveis e biocompatíveis da seda a tornam adequada para aplicações médicas.
Comparação da resistência à tração do fio de aço e da seda da aranha (densidade correspondente).
Também é curioso que um tipo de aranha possa produzir vários tipos de teias que são diferentes em propriedades e uso (as aranhas da espécie Argiope argentata produzem até 5 variantes da teia):
- para as bordas externas e estrutura da web (muito durável);
- para áreas de captura de presas (muito pegajosas, elásticas e duráveis);
- ( );
- ( 2 3 );
- ;
- .
Esta é apenas uma breve descrição da seda da aranha, mas mesmo assim é suficiente para entender a singularidade dessa substância. É por isso que muitos cientistas vêm tentando há muito tempo criar um equivalente artificial da web. Para muitos, isso é bastante bem-sucedido. No entanto, o problema da produção em massa permanece sem solução.
No trabalho que estamos considerando hoje, os cientistas propuseram uma solução para este problema. Consiste na utilização da bactéria roxa Rhodovulum sulfidophilum , que possui propriedades tanto fototróficas * quanto halófilas * .
Fototróficos * são organismos que usam luz para gerar energia.
Halófilos * são um tipo de extremófilo que vive em condições de alta salinidade.R.sulfidophilum é uma bactéria marinha anoxigênica fotossintetizante * com diferentes características metabólicas que produz biohidrogênio, bioplásticos e ácidos nucléicos extracelulares.
Fotossíntese anoxigênica * - ao contrário da fotossíntese comum, o oxigênio molecular não é formado durante a fotossíntese anoxigênica.Mas a habilidade mais importante do R.sulfidophilum para os cientistas é sua capacidade de crescer em condições fotoautotróficas por meio do uso de recursos baratos e renováveis, como luz (energia), CO 2 (fonte de carbono) e N 2 (fonte de nitrogênio) por meio dos processos de fotossíntese e fixação. azoto. Além disso, R.sulfidophilum prospera na água do mar, o que ajuda a reduzir o risco de contaminação biológica durante o cultivo.
Nos últimos anos, bons resultados foram alcançados na produção em massa de espidroína (MaSp, proteína da seda de aranha) usando organismos hospedeiros recombinantes (bactérias Escherichia coli , levedura Pichia pastoris , bichoBombyx mori , tabaco, culturas de células de mamíferos, etc.).
Os autores deste trabalho não negam o sucesso de seus antecessores, mas observam os volumes de produção extremamente pequenos e o custo bastante elevado do produto final devido ao alto custo da própria produção (no caso da fermentação microbiana, 70% dos custos de produção são matérias-primas).
Em seu estudo, os autores propõem um novo método para a produção econômica e eficiente de seda de aranha usando a bactéria R.sulfidophilum , capaz de produzir uma sequência de repetição hidrofóbica MaSp1 (spidroin-1) usando uma pequena quantidade de matéria orgânica em condições de crescimento foto-heterotrófico ou fotoautotrófico.
Resultados da pesquisa
Primeiro foi necessário preparar a bactéria R.sulfidophilum .
Foi relatado anteriormente sobre a possibilidade de introduzir DNA de plasmídeo exógeno em R.sulfidophilum por conjugação bacteriana * usando plasmídeos derivados de pCF1010 e E. coli S17-1 como uma cepa doadora.
Conjugação * - transferência unidirecional de uma parte do material genético durante o contato direto de duas células bacterianas.Neste estudo, foi decidido usar um vetor diferente (pBBR1MCS-2) contendo o gene de resistência à canamicina, o gene mob que codifica uma nuclease específica e a fonte de transferência ( oriT * ), que foram amplamente utilizados na conjugação de bactérias gram-negativas.
oriT * é uma sequência curta (até 500 bp) necessária para a transferência do DNA que o contém de um hospedeiro bacteriano para um receptor durante a conjugação bacteriana.No cromossomo de R.sulfidophilum (número de acesso NZ_CP015418), dois genes de resistência a telurito que codificam uma proteína de resistência a telurito da família TerB estavam presentes nos loci A6W98_RS06280 e A6W98_RS17070.
Traços de resistência à canamicina e telurito foram usados como marcadores para a seleção de conjugantes positivos de R. sulfidophilum .
O plasmídeo * pBBR1-Ptrc-MaSp1 continha:
- o promotor * trc (Ptrc), que é um potente promotor híbrido constitutivo em E. coli;
- a sequência "AGGAGA" da região de ligação ao ribossoma (RBS);
- MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).
* — , .
* — , - ( ).Aproximadamente 0,4 g de massa celular úmida (CWM de massa úmida de células ) foram obtidos a partir de 50 ml de cultura recombinante de R. sulfidophilum cultivada até crescimento estacionário em condições foto-heterotróficas, ou seja, de caldo marinho (MB de caldo marinho ) com iluminação LED em (730 nm, 20-30 W / m 2 ), durante 4 dias.
Imagem # 1
Apesar do fato de que a superexpressão das proteínas MaSp1 recombinantes não foi detectada claramente em todas as culturas recombinantes de R. sulfidophilum usando eletroforese em gel de poliacrilamida / SDSPAGE ( 1c), a expressão positiva de proteínas MaSp1 foi confirmada por imunotransferência de proteína para todas as células R.sulfidophilum recombinantes criadas carregando pBBR1-Ptrc-MaSp1- (1-mer, 2-mer, 3-mer ou 6-mer) ( 1d ).
Medidas K * - subsequências de comprimento k contidas em uma sequência biológica.O único domínio de repetição nas construções resultantes contém 33 resíduos de aminoácidos da seguinte forma:
NH 2 -SGRGGLGGQGAGAAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH.
O peso molecular teórico das proteínas alvo, incluindo sequências não hidroína (regiões de clivagem de His-Tag, S-Tag, enterocinase e trombina) no N-terminal é 7,9 kDa para 1-mer (81 aa); 10,5 kDa para 2-mer (114 aa); 13,1 kDa para 3-meros (147 aa) e 20,9 kDa para 6-meros (246 aa).
Sim - designação da unidade de massa atômica; kDa - quilodalton (1 kDa = 103 Da).Além de confirmar a expressão de proteínas MaSp1, sua quantidade de proteínas MaSp1 obtidas a partir de culturas recombinantes de R.sulfidophilum também foi avaliada : ~ 3-10 mg / L (1-mer = 3,4 mg / L; 2-mer = 3,9 mg / L ; 3-mer = 10,2 mg / l; 6-mer = 6,8 mg / l) ou 3,5-6,9% da quantidade total de proteínas. Para comparação, a expressão heteróloga de spidroins no conhecido e amplamente utilizado sistema recombinante de E. coli é capaz de produzir apenas ~ 0,3-1,2 mg / L de spidroin purificado.
O alelo dominante é indicado por uma letra maiúscula (A versus a). Visto que cada pai fornece um alelo, as seguintes combinações são possíveis: AA, Aa e aa.
O resultado mais surpreendente, segundo os cientistas, neste estudo é a demonstração de fábricas de células microbianas, baseadas em organismos fotossintéticos marinhos, nas quais um regime de crescimento fotoautotrófico pode ser aplicado utilizando matérias-primas não alimentares renováveis e água do mar como meio de cultura.
R.sulfidophilum , carregando pBBR1-Ptrc-MaSp1- (6-mer), foi cultivado em água do mar artificial (Daigo ASW de água do mar artificial) quando iluminado por LEDs (730 nm, 20-30 W / m 2 ) com o sal de bicarbonato (1 g / l) como fonte de carbono inorgânico e gás nitrogênio (0,5 l / d) como fonte de nitrogênio. O tempo de cultivo foi de 7 dias ( 2a ).
Imagem No. 2
A maior unidade constituinte, MaSp1- (6-mer), foi escolhida para experimentos subsequentes porque um peso molecular mais alto de MaSp1 resultaria em uma maior resistência à tração da fibra de seda da aranha. O bicarbonato de sódio tem sido usado para fornecer carbono inorgânico porque os sais de bicarbonato têm maior solubilidade e menores custos de transporte do que o gás CO 2 .
Anteriormente, os cientistas já realizaram experimentos para determinar as condições de iluminação necessárias para o crescimento das células de R.sulfidophilum : intensidade (8 e 50 W / m 2 ) e comprimento de onda (730, 800 e 850 nm). Este estudo avaliou o efeito de crescimento de R.sulfidophilum recombinantevários nutrientes adicionais (extrato de levedura, vitamina, ferro e fósforo) que são deficientes em meio ASW.
A massa de células secas (CDM) diminuiu de 0,90 g / L (com todos os nutrientes) para 0,66 g / L na ausência de extrato de levedura e para 0,39 g / L na ausência de fósforo. Também foi determinado que R.sulfidophilum recombinante não pode crescer em ASW sem NaHCO 3 , gás N 2 ou fósforo ( 2b ; ASW + N 2 , ASW + C + N 2 , ASW + C + P e ASW + P + N 2 ).
CDM (~ 0,4 g / L) em tais variantes de meio ASW, muito provavelmente, originado de inoculantes *ou inóculo mesmo após as amostras terem sido lavadas com cloreto de sódio a 2%. Assim, fontes de carbono, nitrogênio e fósforo são necessárias para o crescimento de R.sulfidophilum recombinante em meio ASW.
Inoculante microbiológico * - produtos biológicos que contêm culturas vivas de microrganismos úteis para as plantas.Como esperado, o crescimento celular aumentou significativamente de 0,34 ± 0,02 g / L (ASW + C + N 2 ) para 0,58 ± 0,08 g / L (aumento de 1,7 vezes) e 0,81 ± 0,02 g / L (aumento de 2,4 vezes) na presença de extrato de levedura (ASW + C + N 2 + YE) e fósforo (ASW + C + N 2 + P), respectivamente.
O maior CDM foi alcançado pela adição de extrato de levedura e fósforo, dando 1,04 ± 0,06 g / L (um aumento de 3,1 vezes).
O rendimento de ~ 0,2 mg / L da proteína recombinante MaSp1 (2% da quantidade total de proteínas) foi observado nas condições de ASW + N 2 , ASW + C + N 2 , ASW + C + P e ASW + P + N 2 ( 2c e 2d) A produção da proteína MaSp1 foi auxiliada pela adição de um extrato de levedura, que aumentou significativamente o rendimento da proteína MaSp1 de 0,12 ± 0,10 mg / L (ASW + C + N 2 ) para 3,93 ± 2,76 mg / L (ASW + C + YE + N 2 ).
A adição de levedura também aumentou a porcentagem de MaSp1 nas proteínas totais de 1,2 ± 1,0 para 6,9 ± 5,3%. Curiosamente, a adição de fósforo, embora tenha afetado positivamente o aumento do MDL, afetou negativamente a produção da proteína MaSp1.
Em comparação com ASW + C + YE + N 2 no meio ASW + C + YE + P + N 2 , o rendimento da proteína MaSp1 diminuiu para 2,71 ± 1,09 mg / L, e a porcentagem de MaSp1 nas proteínas totais diminuiu para 3,9 ± 1,6%.
A explicação para essas diferenças na produção de proteínas dependendo do meio de cultura pode estar na funcionalidade de cada um dos componentes. Por exemplo, o extrato de levedura é principalmente uma fonte de nitrogênio que promove a biossíntese de proteínas. Enquanto isso, o fósforo é um importante macronutriente e heteroelemento em muitos compostos celulares importantes, o que promove o crescimento de produtores primários.
Para obter a seda de aranha em sua forma usual, foi necessário purificar MaSp1.
Imagem # 3
Para obter proteína MaSp1 suficiente para extrusão de fibra, a fermentação ( 3a ) foi realizada para produzir MaSp1- (6-mer).
Em geral, o tamanho das spidroins é positivamente correlacionado com a resistência à tração para um peso molecular especificado. Proteínas maiores têm mais interações entre cadeias e intracadeias, mais emaranhados e menos defeitos da cadeia final.
A purificação de MaSp1- (6-mer) foi realizada usando cromatografia de afinidade através de um marcador de histidina, que estava presente no terminal N do cassete do gene MaSp1, e cromatografia de filtração em gel. Como resultado, ~ 10 mg de MaSp1- (6-mer) ( 3b ) purificado foi obtido a partir de ~ 40 g de CWM.
As fibras de seda foram preparadas pipetando 10% em peso de MaSp1- purificado (6 medidas) dissolvido em hexafluoroisopropanol (HFIP) em um banho de coagulação seguido de tração manual com uma pinça ( 3c) Os melhores resultados foram obtidos usando 90% de 2-propanol como banho de coagulação, o que causou uma desidratação relativamente suave, o que permitiu uma tração eficiente do fio. A análise por microscopia eletrônica de varredura mostrou que as fibras têm um diâmetro de 10–20 µm e uma superfície coberta com ranhuras paralelas ao eixo da fibra. A fractografia mostrou que a estrutura interna consistia em microfibrilas ( 3d e 3e ).
Para um conhecimento mais detalhado das nuances do estudo, recomendo que você leia o relatório dos cientistas e materiais adicionais a ele.
Epílogo
Neste trabalho, os cientistas falaram sobre o sucesso da criação de uma micro-fábrica para a produção da proteína MaSp1. O principal líder dessa produção é a bactéria R.sulfidophilum , graças à qual foi possível atingir a expressão foto-heterotrófica de uma proteína artificial da teia de aranha em condições de crescimento fotoautotrófico.
Em outras palavras, os cientistas modificaram geneticamente a bactéria para produzir seda de aranha, mais especificamente a proteína MaSp1, que é um componente importante dela. Além das manipulações genéticas, também era necessário estabelecer as condições ideais para o cultivo da bactéria. Acontece que o ambiente ideal é a água do mar artificial. Além disso, foi necessário usar gás nitrogênio e extrato de levedura como fontes de nutrientes. Juntos, esses constituintes levam a um crescimento bacteriano eficiente e, portanto, à produção da proteína da teia de aranha.
Também é importante que as fibras da teia de aranha obtidas a partir da proteína sejam muito semelhantes em estrutura às naturais produzidas pelas aranhas da espécie Nephila .
Os cientistas observam que seu método de cultivo de proteína de seda de aranha pode ser usado para cultivar outras substâncias também. No futuro, os autores do estudo planejam melhorar sua microfábrica para aumentar o volume de produção de proteínas e melhorar as características moleculares do produto resultante.
Segundo os cientistas, seu trabalho pode contribuir para a solução de muitos problemas: crises de energia, água e alimentos, problemas com resíduos sólidos, aquecimento global, etc. A razão para essa ampla gama de possibilidades é o fato de que essas fábricas produzem materiais biodegradáveis e biocompatíveis usando um processo neutro em carbono.
Obrigado pela atenção, fiquem curiosos e tenham uma boa semana de trabalho, pessoal. :)
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